アガロースゲル電気泳動の方法と原理 【失敗原因の考察も】
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アガロースゲル電気泳動法は核酸のサイズを利用して分離する方法で、世界中の研究室で毎日行われています。

この記事では、学生さん向けにアガロースゲル電気泳動で知っておくべき全てのことをまとめました。

アガロース電気泳動の原理

アガロース(agarose)は、寒天生産性を有する海藻から抽出された中性多糖で、寒天のゲル化において大きな役割を担っています。

1→3結合β-D-ガラクトースと1→4結合3,6-アンヒドロ-α-L-ガラクトースの交互結合からなっていて、市販されているアガロースは1本の鎖につきこのようなガラクトースが800ほど連なっています。

アガロースをバッファーに溶かして作成するアガロースゲルは、比較的大きな網目構造になり、より小さな分子は早く移動することができます。

DNAなどの核酸は負の電荷を持つので、アガロースゲルの片側に入れて電流を流すと、核酸は陽極に引き寄せられて移動します。

(この時、泳動槽では水の加水分解が両極で始まり、陰極では4 H2O + 4 e– → 2 H2 + 4 OH–により水素が発生、陽極では、2 H2O → O2 + 4 H+ + 4 e– により酸素が発生しています。)

より具体的には2本鎖のDNAは、その塩基のlog10をとったものに反す比例した速度で流れます (Helling et al., 1974)。

そのため、核酸の大きさに応じて分離できるというのが電気泳動の大まかな原理です。

アガロースゲル電気泳動で準備するもの

泳動したいサンプルの他に準備するものとしてはこのようなものがあります。

泳動に使うバッファー

アガロースゲル電気泳動には、専用のバッファー (緩衝液)が必要です。例えば、バッファーではなく水を使ってゲルを作ってしまった場合、電気は流れず泳動できません。
反対に10倍濃いバッファーを使った場合には通常の電圧であってもたくさんの電気が流れ、泳動はすぐに終わってしまいます。
熱が発生し、最悪の場合事故につながる恐れもあります。

泳動バッファーには大きくTAE (Tris-Acetate-EDTA) , TBE (Tris-Borate-EDTA) , TPE (Tris-Phosphate-EDTA)の3種類があり、いずれもストック溶液を作成し室温保存し、必要な時に希釈して使用します。

これらは基本的にどれでもOKで、どれを使うかは好みによるところもあります。

細かい違いとしては、TAEはTBEやTPEに比べてバッファーの劣化がしやすいという弱点があります。緩衝能が落ち、陽極側のpHが酸性になっていきます。
見分け方としては、ローディングバッファー中のブロモフェノールブルーが黄色になりはじめた状態がpH 4.6であり、バッファーの劣化が始まっています。

この状態になると作り直さなくてはいけません。

TBEやTPEはTAEよりも劣化しにくいものの、TAEより少しだけ高価です。

また、2本鎖DNAはTAEで流した方がTBEやTPEよりもおよそ1割早く流れるので、特に高分子の解像度はTAEの方が上回ります

このため長いDNAを解析するサザンブロットではTAEを使います。反対に短いDNAに関してはTBEの方が解像度が高いです。

よく使われる電気泳動バッファーをまとめました。

TAE 242 gのトリスに氷酢酸57.1 mlと、0.5 M EDTA (pH 8.0) 100 mlを加え、MilliQで1 Lにメスアップして10xでストック ストックをMilliQで10倍に希釈して (1xで)使用。最終的には40 mM Tris-acetate、1 mM EDTAになる
TBE 54 gのトリスに27.5 gのホウ酸と0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 mlを加え、MilliQで1 Lにメスアップして5xでストック (10xでストックすると沈殿する) ストックをMilliQで10倍に希釈して (0.5xで)使用。最終的には45 mM Tris-borate、1 mM EDTAになる
TPE 108 gのトリスに15.5 mlのリン酸 (85%) と20 mlの0.5 M EDTA (pH 8.0) を加え、MilliQで1 Lにメスアップして10xでストック ストックをMilliQで10倍に希釈して (1xで)使用。最終的には90 mM Tris-phosphate、2 mM EDTAになる

TAEの場合には50×のストックを作っておいて50倍希釈する方法もあります。
TBEはバッファーとしての効果は0.5×で充分ですが、1×の溶液を使う人もいます。

TBEに含まれるホウ酸が、次の生化学反応を阻害することもあることには注意が必要です。

泳動に使うゲル

大きく通常のアガロースゲルlow-meltingゲルの2種類がありますが、他にもintermediate melting ゲルやさまざまな種類のゲルがあります。

精製度の低い(安価な)アガロースは不純物を多く含み、特にDNAをアガロースゲルから回収する場合に、次の酵素反応を阻害する原因となりますが、ただ検出したいだけの場合には安いアガロースでもいいでしょう。

それぞれのゲルの種類と濃度による分離能の目安はこちらです。

種類 補足 固まる温度 溶ける温度 商品名
Standard Low EEO 35-38℃ 90-95℃ SeaKem LE
Standard ハイテングサ由来 35-38℃ 90-95℃ Agarose-LE
Standard ハイテングサ由来 35-38℃ 90-95℃ Low EEO Agarose
Standard ハイテングサ由来 35-38℃ 90-95℃ Molecular Biology Certified Grade
Standard Low EEO 40-42℃ 85-90℃ SeaKem HGT
Standard ハイテングサ由来 Agarose HGT
High-gel-strengh 34-43℃ 85-95℃ FastLane
High-gel-strengh 34-43℃ 85-95℃ SeaKem Gold
High-gel-strengh 34-43℃ 85-95℃ Chromosomal Grade Agarose
Low melting Low melting 25-35℃ 63-65℃ SeqPlaque
Low melting Low melting 35℃ 65℃ NuSieve GTG
Low melting Ultra-low melting 8-15℃ 40-45℃ SeaPrep
Low-viscosity, low-melting 25-30℃ 70℃ InCert
Low-viscosity, low-melting 38℃ 85℃ NuSieve 3:1
Low-viscosity, low-melting 30℃ 75℃ Agarose HS

Low meltingゲルは、ヒドロキシエチル基を導入することで融点を下げたゲルです。一般的には核酸を回収する目的に使われます。

ゲルになる温度も低く、35℃程度でもまだ液状なので、ダメージなくアガロースゲル中に細胞を埋め込むこともでき、また染色体DNAを埋め込んでパルスフィールドゲル電気泳動する目的にも使います

それぞれのゲルの種類と濃度別の分離能 (bp)はこちらです。

Standard High-gel strengh Low-melting Low-viscosity, low-melting
0.5% 700 ~ 25000
0.8% 500 ~ 15000 800 ~ 10000 800 ~ 10000
1.0% 250 ~ 12000 400 ~ 8000 400 ~ 8000
1.2% 150 ~ 6000 300 ~ 7000 300 ~ 7000
1.5% 80 ~ 4000 200 ~ 4000 200 ~ 4000
2.0% 100 ~ 3000 100 ~ 3000
3.0% 500 ~ 1000
4.0% 100 ~ 500
6.0% 10 ~ 100

泳動に使うローディングバッファー

ゲルローディングバッファーは、DNAを重くしてしっかりwellに沈める意味と、色素で色をつけてどこにいるかをわかりやすくする意味があります。

重りとしてはスクロースやグリセロールが使われ、色素としてはブロモフェノールブルー (BPB)キシレンシアノール (XC) がよく使われて、これらを混合してバッファーを作ります。

BPBの方がXCよりもおよそ2.4倍流れるのが早いです。

0.5x TBEで泳動した場合、BPBはゲルの濃度によらずおよそ300 bpのDNAと同じ位置、XCはおよそ4 kbのDNAと同じ位置に来るので、今どのあたりなのか大体の目安にすることができます。

アガロースゲル電気泳動の手順

作り方を見ていきます。

1. アガロースの重さを量って三角フラスコに入れ、必要量のバッファーを加え、電子レンジにかけアガロースを溶かす。

溶液が泡立たないよう、フラスコを机の上にそって回転させるように揺するのを、溶液が透明になるまで繰り返します。

三角フラスコにはゆるくサランラップをかけ、小さな穴も開けておく (膨張した空気を逃がすため)。熱で水分が飛んでしまうので、溶かしたあとはバッファーが濃くなっていることに注意が必要。レンジに掛ける前に重さを測っておき、溶けたあとにもう一度重さを測って、熱でなくなってしまったバッファー中の水分と同じ量のMilliQを加えてバッファーの濃度をもとに戻す

2. ゲルが手で触れられるくらいに冷えたら(50℃くらい)、ゲル成型トレイに流し込む (熱い段階で入れるとトレイがゆがむことがある)。

ゲルにエチジウムブロマイドを入れる場合には、アガロースが溶けて均一になった溶液にエチジウムブロマイド(10mg/ml)をゲル20mlあたり1μLの割合で加えてよく混合してからトレイに入れる。

厚さは3-5 mm程度で、入り込んだ空気をとったあと、コームを差し込む。

もし低濃度 (<0.5%) のゲルを作る場合には、最初に1%のゲル (コームなし) をsupporting gelとして注いでおき、固まった上から低濃度ゲルをつくると、操作の途中で壊れるのを防ぐことができる (supporting gelと低濃度ゲルは同じバッファー、同じ濃度のEtBrで作成する)。

3. 室温で30分ほど放置し、固まったらゲルを電気泳動槽にセット

4. ゲルの上面5 mmくらいのところまで電気泳動バッファーを満たす。
泳動バッファーとゲルを作る時に使ったバッファーは同じものを使ってください。

5.ゲルローディングバッファーを加えたサンプルを、ウェルに入れる。
ゲルローディングバッファーの比重が高いのでサンプルは穴の底に沈むはず。

6. TAEであれば10cmあたり (ゲルの長さではなく+極から-極の長さ) 50V前後、TBEの場合には10cmあたり100V前後の電圧をかけて電気泳動を開始 (ミニゲルの場合)。

もし大きいゲルを使う場合には10 cmあたり10 - 50 V前後で泳動する。
これは低電圧であれば、DNAの泳動度は電圧にほぼ比例するものの、高電圧だと特に高分子の泳動度が比例関係にならず解像度が落ちてしまうからです。

7. BPBやXCなどの色素を指標に、いいところで電気泳動を止める (30分前後)。

8. ゲルにEtBrが入っていない場合には染色を行う。ゲルが浸る程度の泳動バッファーをタッパーなどの容器に入れ、バッファー100mlあたり5 μlの割合でエチジウムブロマイド溶液を加える。そのタッパーをシェーカーに載せて軽く振とうしながら室温で30分ほど染色。ゲルにもとからEtBrが入っているならこのステップは不要。

エチジウムブロマイド染色後の脱染色は通常は不要だが、もし10 ng未満のようなごく少量のDNAを見たい場合には、MilliQで室温20分ほどゲルを浸して脱染色し、結合しなかったエチジウムブロマイドを除くとバンドが見やすくなる。

SYBR Goldで染色する場合には泳動バッファーでSYBR Goldを10000倍希釈する。

9. トランスイルミネーターにサランラップを敷き、その上にゲルをのせてUVで照らす。蛍光ものさしも一緒に写しておくといい。

エチジウムブロマイドと電気泳動で検出できる核酸の量

エチジウムブロマイド (EtBr) は粉末をMilliQで10 mg/mlになるように溶かし遮光して保存します。通常は20000倍希釈して、つまり最終的に0.5 ug/mlになるようにして使用します。

核酸2.5 bpごとに1エチジウムブロマイド分子がインターカレートします。DNAとインターカレートしたエチジウムブロマイドは遊離のものに比べて蛍光が20-30倍強くなるので、UVをゲルにあてることでDNAを検出できるという原理です。

標準的な0.5 cm幅のバンドの場合、エチジウムブロマイドを使った場合には2 ng程度まで見えます。ちなみに1kbpのバンドの場合,これは100億分子相当です。つまり100億分子あってはじめて電気泳動で検出できるようになるということです。

逆にもし500 ng以上のDNAをアプライした場合、スマイリングやスメアなどになりきちんとバンドを見ることができないことにも注意です (これは単一バンドの話で、いろいろな長さの混ざりものDNAであれば、20-30 ugくらいのせてもきちんと見えることがある)。

EtBrは1本鎖も2本鎖核酸も検出できるが、1本鎖核酸へのアフィニティは低く、蛍光強度も弱いです。実際1本鎖のDNAやRNAを検出する際は、分子内で部分的に2本鎖になっているところのシグナルをより強く反映しています。

もしアクリルアミドゲルを作る場合には、エチジウムブロマイドはアクリルアミドの重合を阻害してしまうので、前もってゲルにエチジウムブロマイドを入れておくことはできないことに注意です (アクリルアミド電気泳動の場合には後でエチジウムブロマイド染色をする)。

SYBR GoldはEtBrよりも1000倍近く高感度です。1本鎖RNAでも2本鎖DNAでも、中性ゲルでも変性条件でも使用することができ、2本鎖DNAバンドなら20 pg、1本鎖DNAバンドなら100 pg, 1本鎖RNAバンドなら300 pgあれば検出できます。

SYBR Goldは泳動をゆがめてしまうので泳動前のゲルに入れておくことはできず、後染めが必要です (原液を10000倍希釈)が、バンドを回収してエタノール沈殿をすれば沈殿には来ないので核酸からSYBR Goldを除けるし、SYBR Gold染色したゲルをそのまま膜に転写してサザンやノザンブロットをすることも可能です。

SYBR Goldは高価なので毎日使うわけにはいきませんが、放射能 (RI) を使う実験に迫る感度を出すことができます。

他にもSYBR Green Iは二本鎖DNAの、SYBR Green IIはRNAや一本鎖DNAの染色に使用できます。

アガロースゲルからDNA抽出を簡易的に行う方法

DNA断片をゲルから回収するには, 低融点アガロースを用いてアガロースを溶かして回収する方法、NaIでアガロースを溶解する方法、DNAをガラスビーズに吸着させて回収する方法などいろいろあり、それぞれ特徴があります。

特殊な試薬を一切使わず、DNAを簡単にゲルから回収する方法をここでは解説します。あまり長いDNAの回収に向かないという欠点はありますが、数100bpから数kbくらいまでのDNA断片の回収には十分です。

原理

原理として、ゲルを凍らせるとゲル中の水が結晶化し、ゲルがすかすかになります。ここにフェノールを入れると、その部分にフェノールが入り込み、その結果フェノールよりも密度が大きくなり、遠心分離した場合はアガロースがフェノールの下に沈み、核酸を含む水層はフェノール層の上に追い出されてくるという原理です。

手順

1. 1.5mLのマイクロチューブの底に18Gの注射針で大きめの穴をあける。フタも同様に空気穴をあける(縁が滑らかでないとゲルがひっかかるのでチューブの内側から外に向けて注射針を刺す)

2. 穴のあいたマイクロチューブを新しいマイクロチューブの上に重ねる。これを切り出すバンドの数だけ用意。
2段重ねができない遠心機の場合には、0.5mlのチューブと組み合わせるといい。

ただし100μLほどゲルがたまるとそれ以上は落ちなくなってしまうので頻繁に取り替える必要があります。

3. DNAを電気泳動して必要なバンドをメスで切り出す

4. 切り出したゲルを2段になったマイクロチューブの上に入れる(2%程度の固いゲルの場合は、あらかじめゲルを細かいサイの目に切っておきそれをチューブに入れる)

5. 2段重ねのマイクロチューブを8000rpm, 5分遠心

6. もしゲルが上に残っていたら追加で5分遠心

7.ゲルが全て下に落ちたら等量の平衡化中性フェノールを加え、フタをしてよく混合する(絶対にPCIを使ってはいけない)

8. -70℃~80℃の冷凍庫で30分凍結

9. 室温で融解(フェノール中のDNAは変性温度T mが低くなっているので加熱は好ましくない)

10. 15000rpm, 5分

11. 一番下にアガロース、その上にフェノール、その上に脱水不十分なアガロース、そしてその上に水層になる

12. 水層を新しいマイクロチューブに移す

13. およそ等量のPCIを加えvortex

14. 15000rpm, 5分

15. 水層を新しいマイクロチューブに移しエタノール沈殿する

アガロースゲル電気泳動に失敗した時に確認すること

うまく泳動できなかった時、これらの点をもう一度確認しましょう。

泳動バッファーの代わりに水を使用していないか

アガロースゲル電気泳動では、泳動の際にTAE, TBE, TPEバッファーを使用します。もし泳動バッファーの代わりに水を使った場合、全くバンドが見えません。

アガロース濃度は正しいか

目的のバンドに適していない間違ったアガロース濃度を使用すると、DNAバンドが見えないこともあります。
また、アガロース濃度が低いゲルを使用する場合は、ゲルが割れやすくなります。

ゲルは厚すぎないか

5mmよりも厚いゲルを使用すると、バンドがぼやけたり、染色のバックグラウンドが高くなる原因になります。

泳動バッファーの量は適量か

泳動バッファーは、水面の高さがゲルの3~8mm上になるくらいの量を使用します。

少ないとゲルが乾燥してしまう危険性が高くなります。

過剰量のバッファーは電気泳動槽の陰極と陽極の間の抵抗を下げ、その結果ゲルへの電圧勾配が下がり、DNAの移動度が遅くなります。また過熱やDNAバンドのひずみを引き起こすこともあります。

DNAの量は適切か

少なすぎると検出できず、逆に多すぎるとバンドが歪んでしまいます。

DNAの構造は正しいか

環状 (form I), ニックが入ったもの (form II)、線状 (form III) で泳動速度が変わります。それぞれのフォームの泳動速度は、使用したアガロースの種類や濃度だけでなく、電流の強さやバッファーのイオン濃度などにも影響をうけます。

目的のプラスミドが3 kbだからといって、マーカーの3 kbの場所に出るとは限りません。プラスミドが環状で、マーカーが線状なら比較できないからです。こういう場合は、プラスミドを1箇所の制限酵素で切って線状にしたものを同時に並べて比べる必要があります。

サンプルの塩濃度は同じか

電気泳動するサンプルの塩濃度が異なると泳動パターンが乱れます。

例えば、サンプル1は制限酵素のHバッファーのような高塩濃度なのに、隣に並べたサンプル2は制限酵素のLバッファーのような低塩濃度だとゲル中の電場に乱れが生じます。

電極を付け間違えていないか

電気泳動装置の電極の+とーを間違えると、目的の方向とは逆に泳動されてしまいます。

まとめ

最後に今回の内容をまとめます。

  • 核酸のサイズを利用して分離するのがアガロースゲル電気泳動法
  • アガロースの種類濃度は適切に選択する
  • 失敗の原因は多岐にわたるが、リカバリーもやりやすい

今日も【医学・生命科学・合成生物学のポータルサイト】生命医学をハックするをお読みいただきありがとうございました。

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