タンパク質実験では、タンパクを抽出した後にその濃度測定があります。 この記事では、主に学生さん向けに生命科学実験の基礎であるタンパク質の定量法を紹介しています。
この記事の内容
UV法
原理の概略
UV法は、タンパク質溶液の吸光度を分光光度計で測定する簡単な方法です。 タンパク質に含まれるチロシンやトリプトファン側鎖などの影響により、280 nm付近の光を吸収する一方で、タンパクを溶かすバッファーにはこの付近の波長を吸収するものは少ないのでこれを測定するというものです。
一方で、タンパク質には205 nm付近の吸収 (主にペプチド結合に由来すると言われています) があり、280 nmよりもさらに吸収が大きいので高い感度で測定できるものの、この波長に吸収をもつ物質はタンパク以外にもいろいろあるので、タンパクの定量に使われることはほとんどありません。
UV法の長所はとにかく簡単で、かつ他の方法と異なり定量に使ったサンプルも回収して実験に使えるところがあります。
ただ弱点としてUVの吸収はチロシンやトリプトファンの比率や立体構造に依存する、つまりタンパクによってまちまちなのでよく知っているタンパクにしか使いにくいというところがあります。
やり方と注意点
分光光度計のスイッチを入れ、光源が安定化するのを待った後、波長を280 nmに合わせてゼロ点調節。
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バッファーとサンプルの吸光度 (280 nm)を測定。
注意点として、サンプルを入れるセルには石英製のものの他にもガラス製やプラスチック製のものがありますが、280 nmのような紫外領域を測定できるのは石英製だけです。
ビウレット法
原理の概略
アルカリ性の条件下で銅イオン (Cu2+) をタンパク質溶液と反応させると、Cu1+となってこれがペプチド結合と赤紫色の複合体を形成するので、これを分光光度計で測定するという方法がBiuret (ビウレット)法です。
タンパク質の種類による発色の違いが小さく、界面活性剤の影響を受けにくく、さらに反応液がアルカリ性なので、脂質を多く含むサンプルも可溶化しやすいといったメリットがある一方で、感度がやや低い (少なくとも1 mg/mlくらいのタンパクが必要) という弱点があります。
やり方と注意点
1. まずビウレット試薬を作ります CuSO4・5H2O 3 g + Sodium potassium tartrate (酒石酸カリウムナトリウム) 12 g + 水500 mLで撹拌。
さらに19% NaOH 600 mL, ヨウ化カリウム 4 gを加え、MilliQで2Lにメスアップし室温保存します (数ヶ月は使えます)。
2. サンプル (濃度既知のスタンダードも) 100 μlをチューブにとり、Biuret試薬を1 mL加えてボルテックスで撹拌
3. 室温で30分ほど静置後、540 nmの吸光度を測定する
Lowry法
Biuret法を改良したのがLowry法で1951年に開発されています。タンパク質の溶液をアルカリ性条件下で銅イオンCu2+と反応させ、そこにFolin試薬を加えます。 すると一価銅イオンによってリンモリブデン酸-タングステン酸複合体が還元され、青く発色します。
0.2 mg/mlのタンパクから測定できるのはBiuret法より改善していますが、界面活性剤やEDTAに代表されるキレート剤、2-mercaptoethanolなどの還元剤など、多くの物質によって妨害されてしまうという弱点があります。
BCA法
Lowry法を改良したのがBCA法で1985年に発表されました。Folin試薬ではなくBicinchoninate (BCA) を加え、これが一価銅イオンと複合体を形成して紫に発色する反応を使っています。
Lowry法の欠点であったさまざまな妨害物質の影響を受けにくくなっており、さらに感度もやや改善し0.1 mg/ml程度あれば検出可能です。
そのため、Bradford法と並んで、広く使われている定量法の1つです。 注意点として、室温でも発色は少し進むため測定時間に注意が必要です。
Bradford法
原理の概略
塩基性・芳香族アミノ酸の側鎖とCoomassie brilliant blue G-250という色素の結合の結果、吸収のピークが465 nmから595 nmに変化することを応用した方法で、1976年に考案されました。
BCA法と比べてより簡単で速く、かつ高感度 (0.02 mg/mlくらいから検出可能) 、EDTA・還元剤の影響を受けにくいというメリットがありますが、反対に界面活性剤の影響を受けやすいとか、反応液が酸性で脂質を大量に含むサンプルでは沈殿しやすいなどのデメリットもあります。
やり方と注意点
Bradford試薬 (自作もできますし、各メーカーから市販もされています) を1 mL, サンプルを100 ul加える
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よく撹拌して、5分くらいしてから595 nmの吸光度を測定する フリーのアミノ酸・ペプチドには発色は起こらず、青の発色が起こるためにはタンパク質の分子量は少なくとも3000 Da以上必要とされています。 またBradford試薬は冷蔵保管ですが、使用直前には室温に戻しておく必要があります。
関連図書
この記事に関連した内容を紹介している本やサイトはこちらです。
BCA法、Bradford法、Lowry法など、“総”タンパク質定量法の原理まとめ
SDS-PAGEの原理とプロトコル 【その他のタンパク泳動方法も】
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