哺乳類細胞へのトランスフェクション法5種類【原理の概要】

ヒトやマウスなどの真核生物細胞へ遺伝子を入れる (トランスフェクション) 方法には、いくつか種類があります。大きく、生化学的方法によるトランスフェクション、物理的方法によるトランスフェクション、そしてウイルスによるトランスフェクション (正確にはインフェクションといいます) に分類できます。この記事では、ウイルス以外の2種類の方法について概略をまとめます。

この記事の内容

1 生化学的な方法によるトランスフェクション
2 物理的な方法によるトランスフェクション
3 一過性発現と安定発現
- 3.1 一過性トランスフェクション
- 3.2 安定型トランスフェクション
4 まとめに代えて

生化学的な方法によるトランスフェクション

リン酸カルシウムがある状態で、DNAが細胞に取り込まれることを発見した最初の報告は、おそらくGrahamらによる1973年の発表だと思います。それ以降、リン酸カルシウム法やジエチルアミノエチル（DEAE）デキストラン法はこれまで長い間ずっと使われてきました。より最近では、カチオン性脂質（リポソーム）を使った試薬が登場し、その効率の高さやさまざまな細胞に使えるという利点から、現在ではリポソームを使ったトランスフェクション (リポフェクション) が主流になっています。

リン酸カルシウム法

リン酸カルシウムはDNAと不溶性の共沈体を形成し、それが細胞表面に付着して、エンドサイトーシスによって細胞内にDNAが入ります。

詳しくはリン酸カルシウム法によるトランスフェクション【圧倒的に安い】にまとめています。

ジエチルアミノエチル（DEAE）デキストラン法

DEAE-デキストランは正に荷電しているので、負に荷電したDNAと容易に結合し、負に荷電した形質膜に結合する凝集体を作ります。細胞内への取り込みはエンドサイトーシスにより行われ、それは浸透圧ショックによって増強されると言われています。

リポフェクション法

カチオン性脂質は、DNA分子と結合する人工膜小胞（リポソーム）を作ります。結果として得られる安定なカチオン性複合体は、負に帯電した細胞膜に付着し融合します。

具体的な方法は、リポフェクション法の原理の概略と試薬・プロトコールの例【トランスフェクションの基本】をご覧ください。

物理的な方法によるトランスフェクション

物理的な方法によるトランスフェクションの代表はエレクトロポレーションです。これは1982年に提唱された方法であり、細胞に短時間の高電圧電気パルスをかけ、細胞膜にナノメートルサイズの穴を開けます。このごく小さな穴を通って核酸が細胞の中に入ります。エレクトロポレーションは専用の装置が必要になるものの、非常に効率的なので、生化学的な方法ではあまり入らない場合には一考の価値ありです。さらにもっと強力に穴をあける方法もあります。ごく小さな金の粒子にDNAを付着させ、それを高圧力で出力できる銃のようなものに装填し、細胞に打ち込むという方法があります。 1993年に考案されて以降、主に他の方法では形質転換が不可能な細胞に使われています。

一過性発現と安定発現

真核生物細胞へのＤＮＡ導入には、一過性トランスフェクションと安定型トランスフェクションという、２種類の全く異なるアプローチがあります。

一過性トランスフェクション

一過性トランスフェクション (transient transfection) では、一時的ではあるが高いレベルの遺伝子発現を得ることができます。トランスフェクションされたDNAは必ずしも宿主細胞の染色体に組み込まれるわけではありません。一過性のトランスフェクションは、短期間で大量のサンプルを分析する場合に選択される方法です。通常だと、トランスフェクション後だいたい1日から4日の間に細胞を採取し、得られたライセートを用いて目的遺伝子の発現量を測定します。

安定型トランスフェクション

安定型トランスフェクション (stable transfection) は、トランスフェクションしたプラスミドが宿主細胞のDNAに組み込まれたクローン細胞株をまず樹立する必要があります。

一過性トランスフェクションでは、プラスミドは細胞の中にたくさんあるので発現量も高くなりますが、ごく一部がゲノムに組み込まれたクローンの場合は、その発現量は一過性トランスフェクションよりも1～2桁低くなることがほとんどです。

方法の概略として、まず一過性トランスフェクションと同じようにしますが、目的のプラスミドがゲノムに組み込まれたことを確認できるような薬剤選択 (G418やピューロマイシン・ハイグロマイシンなど) が行われます。

そこで生き残ってきた細胞 (バルクと呼ばれます) を、今度は非常に薄い濃度で96 well プレートにまく (1 wellに1細胞未満になるような濃度) ことで、個々のwellの中にある細胞は同じクローン由来であることを担保し、増えてきたら順次確認をする手順で樹立されます。

興味のあるcDNA・遺伝子が細胞に毒性を示す場合もあります。その場合は、メタロチオネインプロモーター(Zn2+またはCd2+応答性)、マウス乳腺腫瘍ウイルスLTRプロモーター(グルココルチコイド応答性)、テトラサイクリン応答性プロモーター、昆虫のエキジソン応答性システムのような、誘導的に発現を制御できるプロモーターを使うことで毒性を克服できる場合もあります。

詳細は別の記事にまとめるのでそちらをご覧ください。