蛍光色素の選び方【おすすめ一覧】

蛍光色素は生命医学研究にさまざまな知見をもたらしてきました。現在ではよりたくさんの蛍光色素が利用可能になっており、蛍光染色やFACS等の実験で使われています。

この記事では、それら蛍光色素について、特に代表的なものに絞ってまとめました。

青レーザーで励起される蛍光色素

488 nm 青レーザー

古典的なFITCと、褪色に強いAlexa Fluor 488が最もよく使われます (免疫染色でない限りは安いFITCで十分です)。

FITCよりも明るいVioBright FITCとか、BD Horizon Brilliantもありますが、高価なので予算との相談です。

540 nm 緑レーザー

もともと青レーザーで励起していたが、近年のハイエンドモデルで搭載された緑レーザーで励起した方がよりよい色素にはこのようなものがあります (緑がない場合は青でもOKです)。

このカテゴリーの定番はPEで、明るく使用しやすいです。

Texas Red系 (590-620 nm) の色素も最近は増えてきたので使われるようになってきました。

赤色レーザー

APCチャネルでは、APCとAlexa Fluor 647がよく使われます。

Alexa Fluor 700チャネルでは、Alexa FluorよりもAPC/Alexa Fluor 700のタンデム色素の方が明るいのでよく使われています。Alexa Fluor 700は長期保存をする場合には向いています。

紫色レーザー

405 nmの紫レーザーで励起できる色素として、従来はPacific BlueやBD Horizon V500が使われてきました。

近年、より明るいBrilliant Violet系色素が登場し、使いやすくなっています。少し古い機器だと紫レーザーが搭載されていないこともあるので注意が必要です。

他にもBrilliant Violetには605, 650, 711などのシリーズがあります。

UVレーザーで励起される蛍光色素

細胞膜透過性のDNA結合色素 (特にAT塩基対に特異的) であるHoechst 33342は細胞膜透過性なUV励起の蛍光色素です。

ちなみに他の代表的な各染色試薬との比較はこのようになります。

BD Horizon BUVシリーズというUV励起で6色を染められる色素も開発されています。

蛍光色素の選び方とカタログの見方

蛍光色素にはそれぞれ特性があります。

まず特性の1つ目として、明るさが違うことがあります。基本的には、発現量の低い分子に明るい色素を割り当てるということを目指します。

特性の2つ目として、それぞれの蛍光色素はお互いに漏れこむ可能性があります。なるべく他の色素に漏れこまないように選択する必要があります。

これを行うのに便利な情報がステインインデックスと、各社のスペクトルビューアーです。

ステインインデックス

ステインインデックス (stain index) とは、「陽性細胞と陰性細胞の平均蛍光強度の差 (Diffirence)」をD、「陰性細胞の蛍光の標準偏差の2倍」をWとした時に、

D/W

で計算されます。つまり、ステインインデックスが高いということは、ポジティブとネガティブの分離がよく、ネガティブ細胞のピークはシャープで、使い勝手のよい色素ということになります。

蛍光スペクトルビューアー

それぞれのメーカーが、各蛍光色素の特性を可視化するツール、スペクトルビューアーを提供しています。
BD Bioscience社

BioLegend社

サーモフィッシャーサイエンティフィック社

細胞核・細胞質・細胞膜の染色色素

細胞核を染める蛍光色素

核を生きたまま染めるためには、細胞膜を透過するDNA結合色素を使えば可能です。

たとえば、Hoechst, DRAQ5, AO (Acridine Orange)、SYTO色素などがあります。これらは生細胞だけでなく死細胞や固定・膜透過した細胞も染めます。

もし死んだ細胞の核だけを染色したいなら、細胞膜を透過しない (死細胞は細胞膜が壊れているので通過できる) 色素、PI、DAPI、7-AADなどを使用することができます。

AOは、2本鎖DNAに結合すると緑色、1本鎖DNAまたはRNAに結合すると赤色の蛍光を発します。そのためDNAとRNAを同時に定量できます。

SYTO色素はDNAとRNAの両方に結合する蛍光色素で、SYTO green, SYTO blue, SYTO orange, SYTO redなどがあります。

SYTO色素はHoechst, DRAQ5, AOに比べて細胞毒性が低いというメリットもあります。

細胞質を染める蛍光色素

細胞質の染色にはCFSEが最もよく使われています。前駆体のCFDA-SEには蛍光性はないのですが、細胞膜を通過して細胞内に入るとエステラーゼによって加水分解を受け、蛍光性を持つCFSEになるという原理です。

さらに、細胞内タンパクのアミノ基に共有結合するので、細胞質に長期間保持されます。

同様の原理で動く色素は他にもあります。例えばCalcein-AMが代表的で、これ自体は蛍光性がないものの、細胞内エステラーゼで加水分解されると膜不透過性・蛍光性のCalceinになります。

Calceinは細胞質のタンパクと共有結合しないので、細胞膜に穴が開くと拡散により放出されて蛍光を失うので、細胞障害圧政などにも利用されています。

細胞膜を染める蛍光色素

細胞膜の染色には、Di1, DiO, PKH色素などがあります。いずれも長鎖脂肪族末端を持っていて、これが細胞膜に刺さることで長時間安定的にモニタリングできます。

他には、細胞膜表面のタンパクが持つ糖鎖にレクチンが結合するという性質を利用して、蛍光色素標識レクチンを使って細胞膜表面を蛍光標識することもできます。

まとめ

最後に今回の内容をまとめます。

今日も【医学・生命科学・合成生物学のポータルサイト】生命医学をハックするをお読みいただきありがとうございました。